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一、耐药肿瘤细胞株的建立 细胞在诱导耐药的初期极易死亡，可以通过药物浓度递增法培养耐药细胞株。 1． 首先用最低有效剂量的肿瘤药物持续刺激亲本肿瘤细胞48h，（需要通过药敏试验来确定亲本细胞对药物的最低有效剂量，48h为某种肿瘤药物最佳作用时间，不同的药物可根据具体情况改变培养时间）。 2． 更换新的不含肿瘤药物的培养基继续培养48h，细胞在两种培养基中交替培养，一种含有药物并逐渐增加药物的浓度，另一种不含药物。 3． 重复上述方法，逐渐递增药物浓度，直到在某一高浓度的药物诱导下，细胞生长状态良好。（具体的高浓度可以参考文献，或者以药物的IC50值或IC30值为参考，没有具体标准，最终高浓度诱导出的耐药细胞达到耐药指数>5即可） 4． 持续用此高浓度的药物诱导48h，然后换无药的培养基培养细胞48h，如此反复培养2-3周，筛出耐药的细胞。 5． 将此耐药细胞株在不含药物的完全培养基中培养一个月，直到得到稳定的耐药细胞株，测试其耐药性。 6． 然后用不同浓度的药物诱导亲本肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞48h，例如浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000 µM的药物。根据CCK-8实验测得的吸光度，计算亲本肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞的半数抑制率（IC50），并根据IC50的值计算耐药指数（Resistance Index, RI）。 耐药指数RI=耐药肿瘤细胞的IC50/亲本肿瘤细胞的IC50。 RI>5认为耐药细胞系的耐药性符合耐药菌株的要求。 二、耐药性的鉴定 1、耐药指数（RI）的测定： （1）取对数生长期亲本肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞（每孔细胞量参考CCK-8实验）于96孔板中，用浓度为0.01、0.1、1、10、100、1000、10000 µM的药物诱导亲本肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞48h。 （2）每孔加入10 µL CCK-8溶液，在37 ℃下孵育2h（具体孵育时间参考CCK-8实验）。 （3）每个孔的吸光度在450 nm处测量，根据吸光度计算半数抑制率（IC50），然后根据IC50值计算耐药指数（RI）。耐药指数（RI）=耐药细胞系的IC50/亲代细胞系的IC50, RI>5则认为耐药细胞系的耐药性符合耐药株的要求。 2、多药耐药相关蛋白表达量的测定： (1) 收集对数生长期亲本肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞，从细胞中提取总蛋白质。 (2) BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度，使后续实验上样量一致。 (3) 用聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离总蛋白样品，然后用多药耐药相关蛋白MRP1和P-gp的特异性抗体进行孵育检测，耐药的肿瘤细胞过表达MRP1和P-gp。 3、罗丹明外排功能的检测： （1）取1×106个/ mL的亲本肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞重悬，加入10 µg/mL的罗丹明染色液，37 ℃，5% CO2细胞培养箱避光培养10-30 min。 （2）1000 rpm离心5分钟，用培养基洗涤细胞两次。 （3）将细胞重悬于1ml培养基中，37 ℃，5% CO2培养60 min。可再次对细胞进行洗涤，排除背景的干扰。 （4）将细胞的培养皿放在镜下观察，激发光的波长为488 nm，阻断光的长为515 nm，观察并拍照，亲本肿瘤细胞胞内荧光强度大于耐药肿瘤细胞，因为耐药肿瘤细胞对药物的外排功能增加，导致胞内罗丹明染料外排增加，胞内荧光强度减弱。 
亲本肿瘤细胞和耐药细胞罗丹明外排功能对比（A为正常癌症细胞，B为耐药细胞）
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